摘要：短程反硝化是非常有前景的硝酸鹽廢水前處理方法，可為厭氧氨氧化提供必需的底物（NO₂^--N），而不同碳源投加方式會影響短程反硝化的性能。在進水NO₃^--N為100mg/L、乙酸鈉為碳源、碳氮比為2的條件下，探究了不同碳源投加方式（1次投加、3次投加、6次投加）對短程反硝化氮素轉化特性及反應速率的影響。結果表明，分次投加碳源可以在短時間內啟動高效穩定的短程反硝化，且6次投加方式條件下短程反硝化性能最優。6次投加碳源（t=0/10/20/30/40/50 min）條件下短程反硝化出水NO₃^--N、NO₂^--N平均濃度分別為7.33、60.92mg/L，NO₃^--N至NO₂^--N的平均轉化率（NTR）為86.55%，NO₃^--N比還原速率和NO₂^--N比還原速率分別為26.79、4.14mg/（g·h）。高通量測序結果顯示，擬桿菌門和變形菌門是短程反硝化系統中的優勢菌門。在研究過程中，短程反硝化功能菌屬Thauera豐度逐漸增加，3種投加方式下其相對豐度分別為0、14.29%、17.11%，說明與短程反硝化相關的優勢菌得到富集。

短程反硝化（PD）是指NO₃^--N還原到NO₂^--N的過程，相比于完全反硝化過程可節約60.10%的外加碳源。有研究表明，通過控制污泥類型、碳源種類、碳氮比（C/N值）、pH值、碳源投加方式等條件可以實現短程反硝化和NO₂^--N積累。畢春雪等、張星星等利用不同污泥快速啟動了PD，NO₂^--N轉化率（NTR）分別在80%、70%左右。Ge等研究發現添加不同碳源時，添加葡萄糖碳源條件下亞硝酸鹽積累率最高，較高C/N值會獲得更高的NO₂^--N積累量。Gong等用乙酸鈉作為碳源時，發現在C/N值=1.4～3.5時NO₂^--N都能有效積累。Qian等發現當系統pH值從5.0增至9.0時，反應器中NTR逐漸升高，而且pH值=9.0時短程反硝化關鍵細菌Thauera的相對豐度最高。王淑瑩等研究表明，以污泥發酵液為碳源，分次投加和1次投加對短程反硝化系統中NTR的峰值影響不大，但分次投加更有利于NO₂^--N穩定積累。在反硝化耦合厭氧氨氧化系統中，分次投加污泥發酵液不會降低厭氧氨氧化活性。Du等發現，在反硝化氨氧化（DEAMOX）系統中，總氮超過500mg/L時，分次投加碳源能明顯提升PD過程的NTR。

目前雖有少部分文獻報道了碳源投加方式對PD的影響，但這些研究多是采用短程反硝化-ANAMMOX耦合工藝分析碳源投加方式對整體脫氮效果的影響，而碳源投加方式對PD中氮素轉化特性和轉化速率的影響鮮有研究。因此，筆者采用序批式反應器（SBR）處理模擬硝酸鹽廢水，以乙酸鈉為碳源，探究在不同碳源投加方式下PD工藝的啟動以及運行性能的差異情況，并利用高通量測序技術分析不同條件下微生物群落變化，旨在為硝酸鹽廢水的處理提供理論支持。

01 材料與方法

1.1 實驗裝置

實驗裝置采用SBR反應器，由有機玻璃制成，有效體積為3L，長為11cm，寬為11cm，高為40cm，見圖1。在反應器上方安裝JJ-1型懸臂式攪拌器，攪拌速度為200r/min，以保持反應過程中的完全混合且溶解氧不超過0.2mg/L。使用哈希HQ30d溶解氧儀測定溶解氧，雷弗BT100L型蠕動泵控制進水和碳源投加，德力西2W040-10型電磁閥進行排水。使用YX25L型溫控加熱盤控制反應器內溫度在24～25 ℃。

1.2 實驗方案

SBR每天運行2個周期，每周期進水1.5L，排水比為50%。本實驗分為兩個階段，階段Ⅰ為反應啟動階段：厭氧攪拌360min（包括進水2min），沉淀30min，排水5min；階段Ⅱ為碳源投加方式探究階段：厭氧攪拌240min（包括進水2min），沉淀30min，排水5min。

整個實驗過程進水NO₃--N為100mg/L，使用乙酸鈉溶液（COD為25g/L）提供反應所需碳源，控制反應起始C/N值為2。第Ⅰ階段（第1～10天）分4次投加碳源，即在t=0/1/2/3 h分別投加3 mL乙酸鈉溶液，旨在啟動短程反硝化。第Ⅱ階段采用3種碳源投加方式，即1次投加方式（第11～28天，在t=0min時投加12mL乙酸鈉溶液）、3次投加方式（第29～47天，在t=0/30/60min分別投加4mL乙酸鈉溶液）、6次投加方式（第48～68天，在t=0/10/20/30/40/50 min分別投加2mL乙酸鈉溶液）。3種投加方式各選取3個周期進行單周期連續取樣。每天監測SBR反應器進、出水的NO₃^--N、NO2^--N、pH值。

1.3 接種污泥與實驗進水

接種污泥取自實驗室培養成熟的全程自養脫氮污泥，接種后SBR反應器內混合液的MLVSS為1500mg/L，30d排泥1次。

實驗進水為人工配制的模擬廢水，主要包括NaNO₃、微生物生長所需的營養元素、微量元素A及B溶液，pH值為7.5～8.5。

1.4 分析項目及方法

水樣首先經過0.45μm納濾膜過濾，然后分別采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法、紫外分光光度法、PHS-3C型pH計、馬福爐灼燒重量法測定NO₂^--N、NO₃^--N、pH值、MLVSS；微生物群落結構采用高通量基因測序技術進行分析。

NTR、比轉化速率參考文獻進行計算。

02 結果與分析

2.1短程反硝化系統的啟動

圖2反映了反應器內PD啟動過程中NO₃^--N、NO₂^--N濃度及NTR變化情況。進水NO₃^--N為100mg/L，乙酸鈉為唯一碳源，碳源分4次投入SBR反應器中，PD系統經過19個周期的馴化完成啟動。啟動可分為兩個階段：第1～9周期，PD活性增強階段；第10～19周期，PD活性穩定階段。第1～9周期，反應器出水NO₃^--N濃度從26.89mg/L降至12.39mg/L，NO₂^--N濃度從0.75mg/L增加到44.9mg/L，NTR從22.00%升至86.17%，此時認為系統中PD性能逐漸增強。第10～19周期，反應器出水NO₃^--N和NO₂^--N平均濃度為12.53mg/L和61.41mg/L，NO₂^--N高積累量得以維持，NTR平均為89.78%、最大為97.09%，說明經過19個周期的馴化，在SBR反應器中成功啟動了PD系統。

目前，大多數研究者啟動PD采用一次性投加碳源的方法。畢春雪等在SBR反應器中通過一次性投加乙酸鈉耗時21d啟動了PD，張星星等采用3種不同的污泥源耗時9d啟動了PD系統，且NTR均僅在70%左右。本實驗采用的SBR反應器僅經過19個周期（10d）的運行，NTR就達到89.78%，在短時間內完成了高效穩定PD系統的啟動，因此可以認為分次投加碳源有利于SBR反應器中PD的啟動。

2.2 碳源投加方式對短程反硝化的影響

2.2.1 氮素轉化特性

不同碳源投加方式對PD系統氮素轉化特性的影響如圖3所示。進水NO₃^--N為100mg/L，一次性投加時，反應器出水NO₃^--N、NO₂^--N平均濃度分別為17.18、49.24mg/L，NTR平均為75.10%、最大達到88.62%。前10d反應器中NTR稍有波動，后趨于穩定。3次投加方式條件下，反應器出水NO₃^--N、NO₂^--N平均濃度分別為12.28、58.9mg/L，NTR平均為81.55%，比一次性投加時高6.45%，NTR最大為88.72%，與一次性投加時相差不大，說明3次投加時反應器出水NTR波動不大。6次投加方式條件下，反應器出水NO₃^--N、NO₂^--N平均濃度分別為7.33、60.92mg/L，NTR平均為86.55%、最高可達96.14%。

在不同的投加方式下，PD系統出水NO₃^--N、NO₂^--N濃度差異明顯。在其他運行條件相同的情況下，隨著碳源投加次數的增多，SBR反應器出水NO₂^--N濃度、NTR呈上升趨勢，NO₃^--N剩余量呈下降趨勢，說明碳源投加次數增多有利于提升反應器內PD活性。碳源分6次投加可以在最大限度上促使NO₃^--N轉化為NO₂^--N，同時進行完全反硝化的NO₃^--N比例下降，因此積累了高濃度的NO₂^--N。少量多次地投加碳源可使反應器中的有機物濃度處于較低水平。在較低的C/N值條件下，硝酸鹽還原酶的活性大于亞硝酸鹽還原酶的活性，NO₃^--N優先還原為NO₂^--N，使NO₂^--N得以積累。

2.2.2 典型周期轉化速率

圖4展示了不同碳源投加方式下SBR反應器中PD典型周期內NO₃^--N、NO₂^--N濃度及NTR變化情況。各條件下典型周期實驗次數為3次。一次性投加時，在前60min，反應器出水NO₃^--N濃度由64.63mg/L降至28.15mg/L，NO₂^--N濃度從12.68mg/L升至41.72mg/L，60min時NTR達到峰值80.09%。在后續180min反應時間內，NO₂^--N僅增加了3.94mg/L，NO₃^--N僅減少了9.45mg/L。3次投加時，反應器出水氮素濃度變化主要在前90min內，NO₃^--N在0～90 min和90～240min的濃度分別下降了43.39、7.37mg/L，NO2--N則分別增加了30.83、4.21mg/L，但NTR峰值仍出現在60min時，為72.46%。6次投加時，在前60min完成了大部分NO₂^--N的積累，反應器出水NO₂^--N增加了33.80mg/L，NO₃^--N減少了39.90mg/L，60min時NTR最大為84.50%。3種投加方式下反應器內NO₃^--N減少量均大于NO₂^--N積累量，二者差值越小，說明反應器內NO₂^--N的還原量越少，NTR越高。

此外，3種投加條件下SBR反應器出水NO₃^--N、NO₂^--N濃度及NTR變化趨勢基本相似。在反應前期，反應器出水NO₃^--N濃度隨著反應的進行而逐漸降低，NO₂^--N濃度不斷積累升高。這是因為在反應初期，硝酸鹽還原菌的底物NO₃^--N和碳源充足，硝酸鹽還原酶可結合的電子供體與受體增加，NO₃^--N可快速轉化為NO₂^--N。反應一段時間后，反應器中NO₃^--N、NO₂^--N濃度變化不大，是因為反應后期NO3--N和碳源濃度較低，反應變慢，NO₃^--N和NO₂^--N變化不明顯，因此二者濃度及NTR比較穩定。有研究表明，當C/N值大于3（超過了完全反硝化所需要的碳源量）時出水NO₂^--N濃度隨反應的進行而先增加后減少。而本實驗中C/N值為2，且通過分次投加降低了反應期間碳源濃度，使反應器中不明顯發生完全反硝化，才成功在反應后期穩定積累NO₂^--N濃度。3種碳源投加方式下，反應器中的NTR呈微弱的先上升后下降的趨勢，且均在60min時達到最大值。經比較可知，6次投加方式下反應器出水NO₂^--N濃度和NTR都達到最高水平。

在前4次取樣時間內，反應器內NO₃^--N減少量和NO₂^--N積累量與時間呈線性關系，R2>0.95。典型周期內的PD反應速率可由擬合后的二者濃度變化以及污泥濃度MLVSS來確定，結果如圖5所示。

在3種投加方式中，6次投加時NO₃^--N比還原速率、NO₂^--N比積累速率最大，分別為26.79、22.65mg/（g·h），3次投加方式的NO₃^--N比還原速率、NO₂^--N比積累速率最小，分別為19.42、13.95mg/（g·h）。此外，無論何種投加方式，NO₃^--N比還原速率遠大于NO₂^--N比還原速率。一次性投加時，NO₃^--N比還原速率是NO₂^--N比還原速率的4.82倍，3次、6次投加時分別為3.55、6.47倍。6次投加方式的NO₃^--N比還原速率與NO₂^--N比還原速率相差最大，NO₂^--N得以更好地積累，與在該條件下PD系統具有較高的NTR相一致。由此可以認為，NO₃^--N比還原速率大于NO₂^--N比還原速率是NO₂^--N積累的直接原因，這與王淑瑩等、Cao等的研究結果相似。

2.3 微生物群落分析

利用16SrDNA高通量測序進一步了解不同運行條件下反應器中微生物群落結構的變化情況。seed取自反應器運行第1天（接種污泥）、R1取自反應器運行第16天（1次投加方式）、R3取自反應器運行第35天（3次投加方式）、R6取自反應器運行第57天（6次投加方式）。4個污泥樣品的Coverage值分別為98.80%、97.68%、99.60%、99.74%，有較高的樣本文庫覆蓋率，說明本次測序有效。Shannon值用來表征微生物群落的多樣性，其數值越大，多樣性越高。seed、R1、R3、R6的Shannon值分別為5.69、8.02、6.19、7.10，說明R1比其他樣品的物種多樣性要高，即seed、R3、R6中微生物的專一性更高，功能細菌的優勢更強。

SBR反應器中各時期污泥樣品門水平、屬水平的微生物群落豐度見圖6。從圖6（a）可知，4個污泥樣品中分別檢測出9、11、18、15種已知菌門，有6種主要菌門（相對豐度>1.0%），分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和Patescibacteria菌門。按照豐度由高到低排序，seed中優勢菌門為擬桿菌門（84.08%）、厚壁菌門（14.86%）；R1中優勢菌門為擬桿菌門（70.50%）、厚壁菌門（25.60%）以及Patescibacteria菌門（1.59%）；R3中優勢菌門為擬桿菌門（38.49%）、變形菌門（32.73%）、綠彎菌門（22.35%）、浮霉菌門（4.28%）；R6中優勢菌為變形菌門（47.71%）、綠彎菌門（22.62%）、擬桿菌門（22.35%）、浮霉菌門（4.96%）。可以發現，R3、R6中出現了seed、R1中沒有的綠彎菌門，綠彎菌門是含有綠色素的兼性厭氧細菌，可以分解糖類物質并進行脫氮。擬桿菌門的豐度逐漸降低，變形菌門的豐度逐漸升高，R6中變形菌門占47.71%，此豐度與已有文獻中活性污泥變形菌門的豐度相近。污水處理中常見的反硝化菌屬大多屬于變形菌門，變形菌門可以在降解有機物的同時脫氮除磷，因此，高豐度變形菌門是PD系統中高NTR的保證。

從圖6（b）可知，R3、R6新增了前兩個樣品中未檢測出的反硝化菌屬Thauera，相對豐度分別為14.29%、17.11%。Thauera是PD研究中實現NO2--N積累的功能菌屬。Du等的研究接種已馴化成功且穩定運行的反硝化污泥，發現在實驗后期Thauera是PD工藝中的絕對優勢菌屬，相對豐度為67.25%。而本實驗接種污泥為實驗室培養成熟的全程自養脫氮污泥，反應后期才出現Thauera，條件的優化使與PD相關優勢菌得到富集，這與6次投加時效果最優的結論一致。

03 結論

①在常溫（24～25 ℃）下，當進水NO₃^--N為100 mg/L、C/N值=2時，碳源分次投加，可以在短時間（10d）內啟動高效穩定的PD系統。

②6次投加方式下SBR反應器中PD運行效能最好。6次投加方式下出水NO₃^--N、NO2--N平均濃度分別為7.33、60.92 mg/L，NTR平均為86.55%，NO₃^--N比還原速率最大［26.79mg/（g·h）］，NO₂^--N比還原速率最小［4.14mg/（g·h）］。

③碳源投加次數增多有利于提升SBR反應器內PD的活性，促進反應器出水NO₂^--N的積累，可為后續ANAMMOX脫氮提供充足的基質。

④擬桿菌門和變形菌門是PD系統中的優勢菌門，在3次投加和6次投加的污泥中出現的新菌屬Thauera是眾多已報道PD研究中實現NO₂^--N積累的功能菌屬，Thauera的富集能維持PD系統的穩定。

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